El etileno producido en los primordios del carpelo controla la expresión de CmHB40 para inhibir el desarrollo del estambre

Jun 21, 2023

Naturaleza Plantas (2023)Citar este artículo

3 altmétrico

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La determinación del sexo evolucionó para controlar el desarrollo de las flores unisexuales. En agricultura, condiciona la forma en que se cultivan y mejoran las plantas. Investigamos cómo se desarrollan las flores femeninas en cucurbitáceas monoicas. Descubrimos en el melón, Cucumis melo, un mecanismo por el cual el etileno producido en el carpelo se percibe en los primordios del estambre a través de receptores de etileno expresados ​​espacialmente de manera diferencial. Posteriormente, el módulo de señalización de etileno CmEIN3/CmEIL1, en los primordios del estambre, activa la expresión de CmHB40, un factor de transcripción que regula negativamente los genes necesarios para el desarrollo del estambre y regula positivamente los genes asociados con la senescencia de los órganos. La investigación de la biodiversidad genética del melón reveló un haplotipo, originario de África, alterado en la unión de EIN3/EIL1 al promotor CmHB40 y asociado con el desarrollo de flores bisexuales. A diferencia de otros mutantes bisexuales en las cucurbitáceas, las mutaciones CmHB40 no alteran la forma del fruto. Al desenredar las vías de determinación del sexo y la forma del fruto, nuestro trabajo abre nuevas vías en el fitomejoramiento.

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Los datos brutos de NGS utilizados y generados en este estudio se depositaron en la base de datos de la SRA con los números de acceso PRJNA917526, PRJNA917594 y PRJNA917630. El genoma del melón Charmono está disponible públicamente en http://cucurbitgenomics.org/v2/ftp/genome/melon/Charmono/. Todos los demás datos están disponibles en el texto principal o en las tablas complementarias. El material biológico descrito puede obtenerse de A. Bendahmane mediante un acuerdo de transferencia de material con el INRAE.

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Agradecemos a P. Audigier, F. Vion y H. Ornstrup por cuidar la planta y las instalaciones de investigación proporcionadas por el Instituto de Ciencias Vegetales Paris-Saclay (IPS2, Francia). Agradecemos al Centro de Recursos Biológicos CRBLeg de GAFL Avignon por mantener, caracterizar y proporcionar recursos genéticos del melón; y a la unidad experimental UE AHM de Aviñón por su experiencia técnica. Este trabajo fue financiado por lo siguiente: Consejo Europeo de Investigación, subvención ERC-SEXYPARTH, 341076 (a A. Bendahmane); Agence Nationale de la Recherche, concesión EPISEX, ANR-17-CE20-0019 (a A. Bendahmane); Agence Nationale de la Recherche, concesión NECTAR, ANR-19-CE20-0023 (a A. Bendahmane); Laboratoire d'Excellence Sciences des Plantes de Saclay, subvención SPS, ANR-10-LABX-40-SPS (a A. Boualem y A. Bendahmane); y la Iniciativa de Excelencia París-Saclay, concesión Lidex-3P, ANR-11-IDEX-0003-02 (a A. Bendahmane).

Estos autores contribuyeron igualmente: Dali Rashid, Ravi Sureshbhai Devani, Natalia Yaneth Rodriguez-Granados, Fadi Abou-Choucha.

Universidad Paris-Saclay, CNRS, INRAE, Universidad de Evry, Instituto de Ciencias Vegetales Paris-Saclay (IPS2), Gif-sur-Yvette, Francia

Dali Rashid, Ravi Sureshbhai Devani, Natalia Yaneth Rodriguez-Granados, Fadi Abou-Choucha, Christelle Troadec, Halima Morin, Feng-Quan Tan, Fabien Marcel, Hsin-Ya Huang, Melissa Hanique, Siqi Zhang, Marion Verdenaud, Clement Pichot, Ying Huang, Moussa Benhamed, Adnane Boualem y Abdelhafid Bendahmane

Universidad Paris Cité, CNRS, INRAE, Instituto de Ciencias Vegetales Paris-Saclay (IPS2), Gif-sur-Yvette, Francia

Dali Rashid, Ravi Sureshbhai Devani, Natalia Yaneth Rodriguez-Granados, Fadi Abou-Choucha, Christelle Troadec, Halima Morin, Feng-Quan Tan, Fabien Marcel, Hsin-Ya Huang, Melissa Hanique, Siqi Zhang, Marion Verdenaud, Clement Pichot, Ying Huang, Moussa Benhamed, Adnane Boualem y Abdelhafid Bendahmane

Genética y Mejora de Frutas y Hortalizas (GAFL), INRAE, Montfavet, Francia

Vincent Rittener y Catherine Dogimont

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CD, A. Boualem y A. Bendahmane concibieron y diseñaron los experimentos. DR, RSD, NYR-G., FA-C., CT, HM, F.-QT, FM, H.-YH, MH, SZ, VR e YH realizaron los experimentos. DR, RSD, NYR-G., FA-C., MV, CP, MB, A. Boualem y A. Bendahmane analizaron los datos. DR, RSD, NYR-G., FA-C., CT, HM, F.-QT, FM, MV, CP, VR, MB, CD, A. Boualem y A. Bendahmane contribuyeron con materiales y herramientas de análisis. DR, RSD, NYR-G., CD, A. Boualem y A. Bendahmane escribieron el borrador original. RSD, A. Boualem y A. Bendahmane editaron el artículo.

Correspondencia a Adnane Boualem o Abdelhafid Bendahmane.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Niels Müller, Manuel Jamilena Quesada y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, En el melón monoico, la mayoría de las flores son masculinas y las femeninas se desarrollan en los nudos de las ramas. Tibish Jebel Kordofan 4 (TK4) desarrolla flores hermafroditas en la posición de las flores femeninas. sg, estigma; st, estambre. Barras de escala, 1 cm. b, Alineación de la secuencia de proteínas de CmACS7 de CharMono y TK4. c, Perfil de expresión de CmACS7 en botones florales pistilados en la etapa 6 de CharMono y TK4. Las barras representan la media ± DE (n = 4 ensayos biológicamente independientes).

a, Representación gráfica de los tipos sexuales de flores observados en las líneas CharMono y TK-BC5. b, CharMono flores masculinas y femeninas. c, flores masculinas y hermafroditas TK-BC5. sg, estigma; st, estambre. Barras de escala en (b) y (c), 2 mm. d, Porcentaje de flores femeninas y hermafroditas entre las flores pistiladas en CharMono, TK-BC5 y en el híbrido F1 resultante. Los datos en d son medias ± sd de 7 plantas independientes. e, Análisis de segregación del fenotipo andromonoico en poblaciones F2. Nb, número total de plantas. Las plantas se consideran monoicas (*) si albergan flores masculinas y femeninas; andromonoico (**) si además de la flor masculina, más del 50% de las flores pistiladas son hermafroditas. f, índice de forma del ovario en CharMono, TK-BC5 y en mutantes de pérdida de función Cmhb-W113* y Cmacs7. Los datos en f son representativos de 20 flores en antesis de 10 plantas independientes. Los valores de P se calculan utilizando ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. g, Distribución de todo el genoma del índice Δ SNP identificado entre los lotes de ADN CharMono y TK4. El índice Δ SNP se muestra según la posición del SNP (Mb) en cada cromosoma. Se confirmó que el índice Δ SNP más alto, punta de flecha roja, que se encuentra en el cromosoma 8, corresponde a la mutación M2.

a, Esquema de las formas sexuales de la línea de pepino monoico de tipo salvaje Poinsett 76 y el mutante TILLING Cshb40W113*. En el pepino monoico de tipo silvestre, las flores se desarrollan siguiendo una secuencia definida a lo largo del tallo principal con cinco nudos con flores masculinas y el sexto nudo con una flor femenina. Las flores femeninas se transformaron en flores hermafroditas en el mutante Cshb40W113* TILLING. b, Presentación gráfica de los tipos sexuales de flores observados en pepino monoico y mutante Cshb40W113*. Cada columna representa una planta individual y cada rectángulo representa un nodo. Los tipos de sexo de las flores se muestran para al menos 20 nodos. Cshb40Q107* tiene una morfo sexual idéntica a la del mutante Cshb40W113*. c, Flores masculinas y femeninas de pepino monoico de tipo silvestre. d, Flores masculinas y hermafroditas del mutante Cshb40W113*. sg, estigma; st, estambre. Barras de escala en (c) y (d), 2 mm. e, índice de forma del ovario en Poinsett 76 de tipo salvaje, en mutantes con pérdida de función Cshb40W113* y Csacs7G33C. Los datos en e son representativos de 25 flores en antesis de 15 plantas independientes. Los valores de P se calculan utilizando ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. f – h, expresión in situ de CsHB40 en botones florales de pepino en la etapa 6. f, flor femenina de tipo salvaje; g, flor hermafrodita del mutante Csacs2; h, flor masculina de tipo salvaje. c, primordios del carpelo; st, primordios de estambre; p, pétalo; s, sépalo. Barras de escala, 100 µm. El análisis de expresión in situ se realizó cinco veces en flores independientes con resultados similares.

Análisis filogénico de proteínas HD-ZIP en Arabidopsis, pepino y melón, inferido mediante el método de unión de vecinos. Las secuencias de proteínas se alinearon y se utilizaron para generar el árbol filogenético de unión de vecinos con 1.000 réplicas de arranque. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque se muestran junto a las ramas. CmHB40 y CsHB40 corresponden a MELO3C007809 en melón y Csa6G501990.1 en pepino, respectivamente.

a, perfil genómico de la región que rodea a CmHB40; Perfil de metilación de TK-BC5 (púrpura), CharMono (verde claro) para el contexto CpG, CHG y CHH y perfil CharMono ATAC-seq. No se detectó ninguna región metilada diferencialmente significativa. b, Distribución mundial de las muestras de melón utilizadas en este estudio. c, haplotipo CmHB40 identificado en muestras de melón de diferentes regiones geográficas. Las accesiones se clasifican en monoicas (M) y andromonoicas (AM) y si albergan el alelo CmACS7 o Cmacs7A57V de tipo salvaje. H1, haplotipo 1.

a, M3 y M4 no están alterados en la secuencia de la proteína CmACS7. b, Análisis de segregación del fenotipo andromonoico en poblaciones de retrocruzamientos M3 y M4 F2. Nb, número total de plantas. c, Distribución de todo el genoma del índice Δ SNP identificado en ADN masivo de plantas segregantes CharMono y M3 F2. d, índice Δ SNP identificado en ADN masivo de plantas segregantes CharMono y M4 F2. Se confirmó que el índice Δ SNP más alto, punta de flecha, encontrado en el cromosoma 2 y el cromosoma 3 corresponde a las mutaciones M3 y M4, respectivamente. El índice Δ SNP se muestra según la posición del SNP (Mb) en cada cromosoma. e, Análisis filogénico de proteínas relacionadas con CmEIN3 en melón y Arabidopsis. Las secuencias de proteínas se alinearon y se utilizaron para generar el árbol filogenético de unión de vecinos con 1.000 réplicas de arranque. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque se muestran junto a las ramas.

a, Los fenotipos de triple respuesta de los mutantes ein3 y eil1. Las plántulas se germinaron en la oscuridad sobre papel empapado en agua en presencia o no de etefón 6 μM. Barras de escala, 3 cm. b, análisis qRT-PCR de CmEIN3 y CmEIL1 en hojas, tallos y botones florales recolectados en la etapa 6. c, Tabla que muestra el efecto de las combinaciones alélicas de CmEIN3 y CmEIL1 en el sexo de la planta. d, Tamaño del estambre observado en las combinaciones alélicas EIN3 y EIL1. Barras de escala, 2 mm. e, Frecuencia de resistencia corta, media y normal en mutantes simples y dobles ein3 y eil1. El doble mutante muestra una resistencia principalmente normal como la que se observa en las flores hermafroditas. f, Fenotipos de morfo sexual y forma del fruto de melón ginoico (mutante wip1) y triple mutante hermafrodita wip1ein3 eil1. Barras de escala, 5 mm. g, h, índice de forma del ovario del melón de las flores mutantes ein3 y eil1 en los orígenes genéticos monoico (g) y gineico (h). i, análisis qRT-PCR de CmWIP1 en botones florales recolectados en la etapa 6 en líneas mutantes de tipo salvaje, hb40, ein3 y eil1. Los datos en byi son medias ± sd de 6 réplicas biológicas. Los valores de P se calculan utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos en e son medias ± sd representativas de 40 flores en antesis en 4 plantas independientes. Los datos en g y h son representativos de al menos 13 flores en antesis en 10 plantas independientes. Los valores de P se calculan utilizando ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

a, Alineación de secuencia del ADN genómico de CharMono y TK4 que se superpone al sitio de unión de EIN3/EIL1. Las secuencias del sitio de unión EIN3/EIL1 de EBS1 están resaltadas en rojo. Se muestra la deleción de 460 pb en el genoma de TK4 y asociada a la andromonoecia. b, 70% ~ Análisis de conservación de secuencia del promotor CmHB40 en especies de cucurbitáceas monoicas. Gráfico mVISTA del promotor CmHB40 y ortólogos de regiones codificantes en especies de cucurbitáceas monoicas. La altura del gráfico en el eje y indica el porcentaje de identidad de nucleótidos (50% –100%). Los picos rosados ​​y blancos indican secuencias de nucleótidos conservadas (SNC) con identidad >70 % y 50 % dentro de 100 pares de bases, respectivamente. La línea roja indica la ubicación del motivo de unión de CmEIN3 validado mediante EMSA. El cuadro discontinuo indica la eliminación de Δ460 en el promotor del genoma TK4. Se utilizó ATAC-Seq para identificar la región de cromatina abierta (ver Fig. 3). c, d, CmEIL1 se une a EBS1 en el promotor CmHB40. c, ensayo EMSA. Se utilizaron una proteína GST o EIL1-GST de 5 μM y una sonda de ADN de 10 nM. P1-m1 a P1-m3, sondas mutantes. GST, glutatión S-transferasa. El ensayo EMSA se realizó tres veces con resultados similares. d, ensayo ChIP-qPCR en protoplasto de melón transformado con 35 S:EIL1-GFP. Los resultados se expresan como porcentaje de la fracción de entrada. Se utilizaron protoplastos de tipo salvaje como controles negativos. Los datos en d son medias ± sd de 3 réplicas biológicas. Los valores de p se calculan utilizando la prueba t de Student de dos colas.

a, diagrama de Venn que muestra la superposición entre los grupos de comparación por pares. Factor R, el factor de representación es el número de genes superpuestos dividido por el número esperado de genes superpuestos extraídos de dos grupos independientes. Un factor de representación > 1 indica más superposición de la esperada de dos grupos independientes. Se indican los valores P de la prueba exacta de Fisher unilateral. b, término GO enriquecido entre los 387 DEG comunes. El valor de P ajustado se calculó mediante la prueba exacta de Fisher unilateral. c, mapas de calor LCM-seq de genes relacionados con etileno, auxina y giberelina expresados ​​diferencialmente en primordios de estambre de flores femeninas, hermafroditas y masculinas.

a, Análisis filogénico de receptores de etileno en melón y Arabidopsis. Las secuencias de proteínas se alinearon y se utilizaron para generar el árbol filogenético de unión de vecinos con 1.000 réplicas de arranque. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque se muestran junto a las ramas. b, análisis qRT-PCR de CmEIN3 y CmEIL1 en hojas, tallos y botones florales recolectados en la etapa 6. c – e, qRT-PCR de CmERS1, CmEIN3 y CmEIL1 en carpelos LCM y primordios de estambres de flores femeninas, hermafroditas y masculinas. f, Formas sexuales observadas en los mutantes TILLING Cmetr1P253S y Cmetr2W530*. Las flores hermafroditas de los mutantes Cmetr1P253S mostraron una amplia variación en el tamaño de los estambres. Mientras que el mutante Cmetr2W530* no tenía flores hermafroditas. Barra de escala, 5 mm. g, Gráfico que muestra la proporción de flores hermafroditas y femeninas en melón monoico (tipo salvaje), mutante homocigoto Cmetr1P253S (etr1/etr1) y mutante heterocigoto Cmetr1P253S (etr1/ETR1). h, A la izquierda, una planta de control WT de melón adulto. En el medio, una planta adulta homocigota para la mutación Cmetr1P253S (etr1/etr1) y heterocigota para la mutación Cmetr2W530* (ETR2/etr2) con retraso en el crecimiento vegetativo e inhibición completa en la floración. A la derecha, una planta de melón adulta homocigota para Cmetr1P253S y tiene alelos WT ETR2. Barra de escala, 15 cm. Los datos en b son medias ± sd de 6 réplicas biológicas. Los valores de P se calculan utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos entre c a e son medias ± sd de 3 réplicas biológicas de LCM. Los valores de p se calculan utilizando la prueba t de Student de dos colas.

Tabla complementaria 1: Lista de mutantes TILLING generados en este estudio. Tabla 2: Orígenes, fenotipos sexuales y haplotipos CmHB40 de todas las muestras de C. melo utilizadas en este estudio. Tabla 3: Genes expresados ​​diferencialmente en primordios de estambre de flores hermafroditas y flores masculinas hb40W113* y acs7A57V. Los datos de expresión de ARN se normalizaron al valor en los primordios de estambre de flores femeninas. Tabla 4: Cebadores utilizados en este estudio.

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Reimpresiones y permisos

Rashid, D., Devani, RS, Rodríguez-Granados, NY et al. El etileno producido en los primordios del carpelo controla la expresión de CmHB40 para inhibir el desarrollo del estambre. Nat. Plantas (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01511-z

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Recibido: 14 de febrero de 2023

Aceptado: 03 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01511-z

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